Escherichia coli – czasem przyjaciel, czasem wróg

• Patogenna E. coli wywołuje niebezpieczną i trudną w leczeniu kolibakteriozę
• Początkowym etapem infekcji jest proces adhezji
• Naukowcy badali rolę adhezyny FdeC w rozwoju kolibakteriozy
• Część badań prowadzono na uniwersytetach w Aarhus i Edynburgu
• Ustalono, że pozbawienie E. coli/APEC genu fdeC zwiększa liczbę bakterii przylegających do komórek gospodarza

– Ten narastający problem naraża hodowców na duże straty. Dlatego tak istotne jest zrozumienie podłoża tych infekcji i opracowanie sposobów zapobiegania im – mówi dr Adrianna Stypułkowska. Jest pierwszą autorką (pod wcześniejszym nazwiskiem Aleksandrowicz, jako doktorantka UPWr) artykułu, który ukazał się w wysoko punktowanym czasopiśmie „Veterinary Research”. We wspólnej  pracy naukowcy z Polski, Danii, Wielkiej Brytanii i Hiszpanii zbadali wpływ genu fdeC na zjadliwość bakterii E.coli. 

APEC – postrach hodowców drobiu

Bakterię Escherichia coli, czyli pałeczkę okrężnicy odkrył w XIX wieku pediatra Theodor Escherich. Od tego czasu została ona gruntownie przebadana, niektóre z badań nagrodzono nawet Noblem. W mikrobiomie ludzi i zwierząt jest nie tylko niegroźna, ale nawet symbiotyczna, m.in. pomaga w produkcji witaminy K w układzie pokarmowym. Czasem jednak, zwykle podczas obniżonej odporności, zaczyna być wrogiem – zamiast utrzymywać prawidłową florę jelitową, niektóre szczepy wytwarzają toksyny i wywołują infekcje układu pokarmowego oraz atakują inne narządy. Patogenna E. coli, w przeciwieństwie do tej niegroźnej, posiada także geny wirulencji, czyli namnażania się i uszkodzenia tkanek zainfekowanego organizmu.

Większość zakażeń dróg moczowych u ludzi to sprawka E. coli. Wnikając do tkanek, może powodować także zapalenie opon mózgowych, zapalenie płuc i sepsę. Szczepy E. coli jako patogeny ludzi i zwierząt wykazują bardzo duży potencjał adaptacyjny, co powoduje, że zdolne są do infekowania różnych gospodarzy i wywoływania wielu jednostek chorobowych. 

Bakterie E. coli są wrażliwe na środki dezynfekcyjne, ale oporne na działanie warunków środowiskowych (w pyle i kurzu potrafią przeżyć kilka miesięcy), dlatego tak ważne jest utrzymywanie odpoowiednich warunków higienicznych na fermie.

Postrachem hodowców drobiu jest APEC (ang. Avian Pathogenic Escherichia coli), czyli E. coli patogenna dla drobiu. Jest czynnikiem etiologicznym niebezpiecznej choroby – kolibakteriozy, o różnym charakterze. Może to być kolibakterioza układu oddechowego, ostra posocznicowa forma kolibakteriozy, postać skórna, a także kolibakterioza narządów rozrodczych. Na zakażenie wrażliwe są wszystkie gatunki ptaków w każdym wieku, jednak atakuje przede wszystkim osobniki młode i z obniżoną odpornością wywołaną na przykład niewłaściwymi warunkami hodowli. Największe straty obserwuje się u kur i indyków rzeźnych w końcowym okresie produkcyjnym, u kur niosek w trakcie nieśności oraz u piskląt po wylęgu – kolibakterioza powoduje zapalenie pępka i woreczka żółtkowego, a zmiany zapalne skutkują wysoką śmiertelnością. Leczenie kolibakteriozy jest utrudnione, ponieważ antybiotyki zawodzą, w związku z nadużywaniem leków antybakteryjnych i powszechnie rosnącą antybiotykoopornością. Coraz częściej występują wielolekooporne szczepy E. coli. Pozostaje profilaktyka, czyli kontrola warunków hodowli oraz szczepienia. 

– Dotychczas nie ma skutecznej szczepionki chroniącej drób przed zakażeniami APEC, głównie z powodu różnorodności serotypów APEC odpowiedzialnych za liczne przypadki kolibakteriozy. Z tego powodu istnieje konieczność opracowania nowych i alternatywnych terapii do zwalczania zakażeń APEC wśród drobiu – mówi dr Stypułkowska. 

– Patogenna E. coli jest problemem zarówno ludzi, jak i zwierząt, a pojawiająca się lekooporność powoduje, że nasze podejście do tego problemu wymaga zmiany. Tutaj pojawia się szansa na znalezienie innych metod zwalczania chorób zakaźnych poprzez badania dotyczące patogenezy. W przypadku naszych badań dogłębne poznanie mechanizmu adhezji bakterii pozwoli na wybranie odpowiednich białek adhezyn. Mogą one być wykorzystane jako antygeny szczepionkowe, czyli pośrednio zapobiegać rozwojowi choroby. Mogą także być celem wiązania czynników antyadhezyjnych, co umożliwi blokowanie przylegania patogenów już w trakcie trwania choroby – opowiada dr Rafał Kolenda, adiunkt w Katedrze Biochemii i Biologii Molekularnej UPWr, obecnie na stażu podoktorskim w Quadram Institute w Wielkiej Brytanii. Jest kierownikiem projektu „FdeC expression regulates motility and adhesion of the avian pathogenic Escherichia coli strain IMT5155”, w którym odpowiadał m.in. za prowadzenie badań laboratoryjnych, zdobywanie środków finansowych, analizę bioinformatyczną genomów E. coli i analizę statystyczną. 

Na pierwszej linii obrony

Zjadliwość pałeczek okrężnicy wiąże się z ich zdolnością do adhezji. To proces polegający na przyleganiu komórek bakterii patogennych, takich jak E. coli lub Salmonella, do komórek gospodarza. Jest początkowym etapem infekcji, a jego powodzenie zapewnia zasiedlenie gospodarza i rozwój choroby. Adhezja może dotyczyć również odziaływań z powierzchniami abiotycznymi (np. zlewozmywak, rura, poidło), przyczyniając się do rozwoju zbiorowiska mikroorganizmów, nazywanych biofilmem. Bakterie w formie biofilmu są znacznie trudniejsze w zwalczaniu, ponieważ są zdecydowanie bardziej oporne na środki przeciwdrobnoustrojowe. 

Pierwszą linią obrony przed bakteriami chorobotwórczymi u gospodarza jest perystaltyka jelit. Mechaniczne ruchy pomagają bowiem usuwać patogeny i zapobiegają ich przyczepianiu się do ścianek jelit. Bakterie wykształciły jednak adhezyny, które umożliwiają im przezwyciężenie niekorzystanego środowiska gospodarza. Adhezyny to struktury zewnątrzkomórkowe bakterii o charakterze białkowym. Do najlepiej zbadanych należą fimbrie typu 1, fimbrie P, fimbrie S oraz rodzina białek Dr. Zdecydowanie mniej zbadaną adhezyną jest białko FdeC.

– Była dotąd badana u uropatogennej E.coli, wykazano jej wpływ na adhezję do komórek nabłonka dróg moczowych – mówi Rafał Kolenda.

Zajmuje się tematem adhezji bakteryjnej od 2010 roku, gdy jako student medycyny weterynaryjnej rozpoczął staż pod opieką dr. Krzysztofa Grzymajło i prof. Macieja Ugorskiego w KBiBM. Jeszcze w trakcie doktoratu w Niemczech (Brandenburgische Technische Universität Cottbus-Senftenberg oraz Freie Universität Berlin) brał udział w projekcie dotyczącym adhezji E. coli patogennej dla drobiu. Wytypowano wówczas geny, których inkatywacja wpływała na oddziaływanie bakterii z komórkami nabłonka drobiu. Jednym z nich był właśnie fdeC. 

– Po powrocie do Polski zdecydowałem się kontynuować badania nad tym genem, jako opiekun pracy magisterskiej Adrianny – opowiada. Była ona wówczas studentką Uniwersytetu Wrocławskiego, ale praca magisterska powstała dzięki współpracy między Katedrą Biochemii i Biologii Molekularnej UPWr a Zakładem Mikrobiologii UWr. Magistrantka dostała za nią wyróżnienia, m.in. w ogólnopolskim konkursie Agroabsolwent na najlepszą pracę dyplomową dotyczącą współczesnego rolnictwa. Wspólnie z opiekunem opublikowali artykuł przeglądowy na temat adhezyn APEC w czasopiśmie „Veterinary Microbiology”. 

– Adrianna postanowiła kontynuować badania naukowe w KBiBM, co dało nam możliwość prowadzenia tego projektu w trakcie jej doktoratu u prof. Grzymajły. Chciałem, aby ten projekt był dla niej przetarciem szlaków i aby umiejętności zdobyte w trakcie jego realizacji mogły zostać przez nią wykorzystane w projekcie doktorskim. Udało mi się nawiązać kilka współprac międzynarodowych, dzięki którym Ada mogła prowadzić badania w laboratoriach w Madrycie, Edynburgu i Aarhus – dodaje Rafał Kolenda.

Od badań adhezji in vitro do analizy proteomicznej

Podczas projektu opublikowanego w „Veterinary Research” naukowcy sprawdzali, jak rolę pełni adhezyna FdeC w rozwoju kolibakteriozy u drobiu. Pierwszym etapem były badania in vitro prowadzone na UPWr. 

– Jako model badawczy przygotowaliśmy mutanta: szczep bakterii APEC, którego pozbawiliśmy genu fdeC – wyjaśnia Adrianna Stypułkowska. 

Kolejny etap polegał na ustaleniu warunków fizykochemicznych (temperatury oraz pH), w których ekspresjonowany jest gen fdeC. Etap ten był kluczowy do przeprowadzenia testów adhezyjnych z użyciem linii kurzych komórek nabłonka jelitowego. Okazało się, że ekspresja genu fdeC była indukowana w temperaturze ciała gospodarza 42 st. C, co jest warunkiem istotnym dla infekcji. 

– Sprawdzaliśmy zdolność przylegania patogennych bakterii, testowaliśmy ich przyczepność i ruchliwość – mówi dr Stypułkowska. – Dzięki środkom pozyskanym przez dr. Kolendę z funduszy Europejskiego Konsorcjum Infrastruktur Proteomicznych (Epic XS) mogliśmy włączyć analizy proteomiczne, oparte na metodach rozdziału białek, spektrometrii masowej oraz technikach bioinformatycznych, które umożliwiają szybką analizę wielu białek jednocześnie. Badania, które prowadziliśmy w Spanish National Cancer Research Center w Madrycie, były doskonałą okazją do nawiązania współpracy z doświadczonymi naukowcami, pozyskania nowej wiedzy oraz wykorzystania kosztownego sprzętu, niedostępnego na macierzystej uczelni. 

Istotną część pracy stanowiła analiza bioinformatyczna. Dr Kolenda za pomocą programów komputerowych sprawdzał genomy dostępne w bazie GenBank, porównywał sekwencje genów w bakteriach E. coli.

– Dzięki analizom bioinformatycznym udało nam się wykazać występowanie wariantów FdeC charakterystycznych dla APEC. W badaniach in vitro pokazaliśmy, że wariant „patogenny” związany z APEC i „niepatogenny” zmieniają fenotyp adhezyjny bakterii z komórkami nabłonka gospodarza – mówi.

RNA pod lupą

W kolejnym etapie, na Uniwersytecie Aarhus w Danii, wykorzystano modele in vivo: pięciotygodniowe kurczęta rasy white leghorn. To gatunek drobiu najczęściej wykorzystywany do badań, ze względu na jednorodność genetyczną, co zapewnia spójność wyników eksperymentów. 

– Poza tym ich wysoka płodność, adaptacyjność oraz liczne, dobrze udokumentowane dane naukowe sprawiają, że są idealne do badań nad zdrowiem, genetyką i produkcją drobiu – mówi współautorka publikacji. Zwierzęta, wolne od patogenów, były hodowane w uniwersyteckich obiektach, z nieograniczonym dostępem do paszy i wody. Żeby zbadać wpływ FdeC na interakcję z gospodarzem, kurczakom podano szczep APEC z lub bez adhezyny FdeC i obserwowano rozwój infekcji.

– Sprawdzaliśmy, jak bakterie namnażały się w organizmach kurczaków oraz jak reagowały one na infekcję. Dzięki zaawansowanym badaniom układu immunologicznego udało nam się zobaczyć, do jakich zmian dochodzi w składzie białych krwinek układu krwionośnego – mówi dr Kolenda. 

Kurczaki poddano eutanazji po 6, 24 i 48 godzinach. Próbki organów zostały wykorzystane do sprawdzenia liczby bakterii zasiedlających poszczególne tkanki, a krew posłużyła do analizy zmian pojawiających się w krwi obwodowej w następstwie infekcji. Na uniwersytecie Aarhus z organów wyizolowano także RNA, które poddano analizom na Uniwersytecie Edynburskim.Wykorzystano do tego celu metodę Fluidigm PCR, która umożliwiła dokładne zbadanie zmian w odpowiedzi immunologicznej kurczaków po zakażeniu bakteriami. Badania in vivo w Aarhus oraz dalsze analizy w Edynburgu prowadzono dzięki funduszom z projektu VetBioNet, które również pozyskał dr Kolenda.

Nieustający wyścig z czasem

Naukowcy odkryli, że pozbawienie bakterii genu fdeC zwiększało adhezję do badanych komórek, powodowało większą ruchliwość bakterii.

– Co więcej, inaktywacja genu fdeC skutkowała słabszą odpowiedzią immunologiczną u kur w porównaniu do szczepu dzikiego – mówi dr Stypułkowska.

Kilka tygodni po publikacji w „Veterinary Research” autorzy z UPWr opublikowali w czasopiśmie „BMC Genomics” kolejną pracę dotyczą wykrywania adhezyn w genomach E. coli.

– Nasze wyniki mają niewątpliwie potencjał do dalszych poszukiwań. Bardzo ciekawe byłoby zbadanie wpływu różnych wersji genu fdeC na kolonizację gospodarza i konkurencję między szczepami Escherichia coli w przewodzie pokarmowym – mówi kierownik projektu. Planuje kontynuację badań dotyczących adhezyn pałeczek E. coli i Salmonella oraz ich roli w patogenezie chorób wywoływanych przez te bakterie. 

– Interesuje mnie, w jaki sposób różnorodność adhezyn wpływa na zdolność bakterii do kolonizacji różnych środowisk. Chcemy również wykorzystać genomikę i metagenomikę do identyfikacji i badania ewolucji patogenów zwierzęcych oraz mikroorganizmów wywołujących choroby przenoszone przez żywność – mówi dr Kolenda. 

– Choroby wywołane przez E. coli i Salmonella mają charakter zoonotyczny, czyli mogą być przenoszone od zwierząt na ludzi, co stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Dlatego tak ważne jest szczegółowe poznanie mechanizmów ich powstawania. Badania nad patogenami to ciągły wyścig z czasem. Mikroorganizmy ewoluują, a wraz z nimi zmieniają się strategie zwalczania chorób zakaźnych. Słowa Sun Tzu: „Jeśli znasz swego wroga, przetrwasz pomyślnie i sto bitew” są w tym kontekście niezwykle aktualne. Im lepiej poznamy biologię patogenów, tym skuteczniej będziemy mogli im przeciwdziałać. To ciągły proces uczenia się i dostosowywania naszych strategii – dodaje.  

Aneta Augustyn